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    微生物菌種的擴大培養技術

    放大字體  縮小字體 發布日期:2019-10-22  瀏覽次數:1310
           菌種的擴大培養是發酵生產的第一道工序,該工序又稱之為種子制備。種子制備不僅要使菌體數量增加,更重要的是,經過種子制備培養出具有高質量的生產種子供發酵生產使用。因此,如何提供發酵產量高、生產性能穩定、數量足夠而且不被其他雜菌污染的生產菌種,是種子制備工藝的關鍵。

    種子擴大培養的任務

           工業生產規模越大,每次發酵所需的種子就越多。要使小小的微生物在幾十小時的較短時間內,完成如此巨大的發酵轉化任務,那就必須具備數量巨大的微生物細胞才行。菌種擴大培養的目的就是要為每次發酵罐的投料提供相當數量的代謝旺盛的種子。因為發酵時間的長短和接種量的大小有關,接種量大,發酵時間則短。將較多數量的成熟菌體接入發酵罐中,就有利于縮短發酵時間,提高發酵罐的利用率,并且也有利于減少染菌的機會。因此,種子擴大培養的任務,不但要得到純而壯的菌體,而且還要獲得活力旺盛的、接種數量足夠的菌體。對于不同產品的發酵過程來說,必須根據菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴大培養的級數,抗生素生產中,放線菌的細胞生長繁殖較慢,常常采用三級種子擴大培養。一般50 t發酵罐多采用三級發酵,有的甚至采用四級發酵,如鏈霉素生產。有些酶制劑發酵生產也采用三級發酵。而谷氨酸及其他氨基酸的發酵所采用的菌種是細菌,生長繁殖速度很快,一般采用二級發酵。

    種子制備的過程

           細菌、酵母菌的種子制備就是一個細胞數量增加的過程。細菌的斜面培養基多采用碳源限量而氮源豐富的配方,牛肉膏、蛋白胨常用作有機氮源。細菌培養溫度大多數為37 ℃,少數為28 ℃,細菌菌體培養時間一般1~2天,產芽孢的細菌則需培養5~10天。 

           霉菌、放線菌的種子制備一般包括兩個過程,即在固體培養基上生產大量孢子的孢子制備和在液體培養基中生產大量菌絲的種子制備過程。 

    ⒈ 孢子制備 

           孢子制備是種子制備的開始,是發酵生產的一個重要環節。孢子的質量、數量對以后菌絲的生長、繁殖和發酵產量都有明顯的影響。不同菌種的孢子制備工藝有其不同的特點。 

           ⑴ 放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養一般采用瓊脂斜面培養基,培養基中含有一些適合產孢子的營養成分,如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1%,氮源不超過0.5%),碳源豐富容易造成生理酸性的營養環境,不利于放線菌孢子的形成,氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下,干燥和限制營養可直接或間接誘導孢子形成。放線菌斜面的培養溫度大多數為28 ℃,少數為37 ℃,培養時間為5~14天。

           采用哪一代的斜面孢子接入液體培養,視菌種特性而定。采用母斜面孢子接入液體培養基有利于防止菌種變異,采用子斜面孢子接入液體培養基可節約菌種用量。菌種進入種子罐有兩種方法。一種為孢子進罐法,即將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐。此方法可減少批與批之間的差異,具有操作方便、工藝過程簡單、便于控制孢子質量等優點,孢子進罐法已成為發酵生產的一個方向。另一種方法為搖瓶菌絲進罐法,適用于某些生長發育緩慢的放線菌,此方法的優點是可以縮短種子在種子罐內的培養時間。 

           ⑵ 霉菌孢子的制備 霉菌的孢子培養,一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。這是由于這些農產品中的營養成分較適合霉菌的孢子繁殖,而且這類培養基的表面積較大,可獲得大量的孢子。霉菌的培養一般為25~28 ℃,培養時間為4~14天。

    ⒉ 種子制備 

           種子制備是將固體培養基上培養出的孢子或菌體轉入到液體培養基中培養,使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子制備所使用的培養基和其他工藝條件,都要有利于孢子發芽、菌絲繁殖或菌體增殖。 

           ⑴ 搖瓶種子制備 某些孢子發芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種,需將孢子經搖瓶培養成菌絲后再進入種子罐,這就是搖瓶種子。搖瓶相當于微縮了的種子罐,其培養基配方和培養條件與種子罐相似。 
    搖瓶種子進罐,常采用母瓶、子瓶兩級培養,有時母瓶種子也可以直接進罐。種子培養基要求比較豐富和完全,并易被菌體分解利用,氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養成分不宜過濃,子瓶培養基濃度比母瓶略高,更接近種子罐的培養基配方。 

           ⑵ 種子罐種子制備 種子罐種子制備的工藝過程,因菌種不同而異,一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中,經培養后形成大量的菌絲,這樣的種子稱為一級種子,把一級種子轉入發酵罐內發酵,稱為二級發酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內,經過培養形成更多的菌絲,這樣制備的種子稱為二級種子,將二級種子轉入發酵罐內發酵,稱為三級發酵。同樣道理,使用三級種子的發酵,稱為四級發酵。

           種子罐的級數主要決定于菌種的性質和菌體生長速度及發酵設備的合理應用。種子制備的目的是要形成一定數量和質量的菌體。孢子發芽和菌體開始繁殖時,菌體量很少,在小型罐內即可進行。發酵的目的是獲得大量的發酵產物。產物是在菌體大量形成并達到一定生長階段后形成的,需要在大型發酵罐內才能進行。同時若干發酵產物的產生菌,其不同生長階段對營養和培養條件的要求有差異。因此,將兩個目的不同、工藝要求有差異的生物學過程放在一個大罐內進行,既影響發酵產物的產量,又會造成動力和設備的浪費。種子罐級數減少,有利于生產過程的簡化及發酵過程的控制,可以減少因種子生長異常而造成發酵的波動。

    種子培養

           種子培養要求一定量的種子,在適宜的培養基中,控制一定的培養條件和培養方法,從而保證種子正常生長。工業微生物培養法分為靜置培養和通氣培養兩大類型,靜置培養法即將培養基盛于發酵容器中,在接種后,不通空氣進行培養。而通氣培養法的生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多,它們生長的環境必須供給空氣,以維持一定的溶解氧水平,使菌體迅速生長和發酵,又稱為好氣性培養。 

           ⒈ 表面培養法 

           表面培養法是一種好氧靜置培養法。針對容器內培養基物態又分為液態表面培養和固體表面培養。相對于容器內培養基體積而言,表面積越大,越易促進氧氣由氣液界面向培養基內傳遞。這種方法菌的生長速度與培養基的深度有關,單位體積的表面積越大,生長速度越快。 

           ⒉ 固體培養法 

           固體培養又分為淺盤固體培養和深層固體培養,統稱為曲法培養。它起源于我國釀造生產特有的傳統制曲技術。其最大特點是固體曲的酶活力高。 

           ⒊ 液體深層培養 

           液體深層種子罐從罐底部通氣,送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養方法,相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養法來講,稱為深層培養法。其特點是容易按照生產菌種對于代謝的營養要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度與培養基中氫離子濃度等條件,選擇最佳培養條件。 

    ⑴ 深層培養基本操作的三個控制點 

           ① 滅菌 發酵工業要求純培養,因此在種子培養前必須對培養基進行加熱滅菌。所以種子罐具有蒸汽夾套,以便將培養基和種子罐進行加熱滅菌,或者將培養基由連續加熱滅菌器滅菌,并連續地輸送于種子罐內。 

           ② 溫度控制 培養基滅菌后,冷卻至培養溫度進行種子培養,由于隨著微生物的生長和繁殖會產生熱量,攪拌也會產生熱量,所以要維持溫度恒定,需在夾套中或盤管中通冷卻水循環。 

           ③ 通氣、攪拌 空氣進入種子罐前先經過空氣過濾器除去雜菌,制成無菌空氣,而后由罐底部進入,再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時間,可在罐內裝擋板產生渦流。攪拌的目的除增加溶解氧以外,可使培養液中的微生物均勻地分散在種子罐內,促進熱傳遞,以及pH均充,并使加入的酸和堿均勻分散等。

    ⑵ 幾種深層培養法 

           ① 控制培養法 根據罐內部的變化情況,掌握短暫時間內狀態變量的變化以及可能測定的環境因子對微生物代謝活動的影響,并以此為基礎進行控制培養,以達到產物的最優培養條件。為此,用測定狀態變量的傳感器取得數據,經電子計算機進行綜合分析,再將其結果作為反饋調節的信號,將環境(培養條件)控制于給定的基準內。這就叫做電子計算機控制培養。目前已大量用于露天大罐啤酒發酵。

           ② 載體培養法 載體培養法脫胎于曲法培養,同時又吸收了液體培養的優點,是近年來新發展的一種培養方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固體基質作為微生物的載體,營養成分可以嚴格控制。發酵結束,只要將菌體和培養基擠壓出來進行抽提,載體又可以重新使用。 

           ③ 兩步法 在酶制劑的兩步法液體深層培養中,每一步菌體相同而培養條件不同,因為微生物生長與產酶的最適條件有很大的差異。例如往培養基中添加葡萄糖能大大增加菌體或菌絲的生長,然而卻嚴重阻礙許多種酶的合成。加強培養液的通氣雖然能促進微生物的生長,可是在多數場合下反而抑制酶的合成。為了取得最大的高活力酶,必須制定一種調節方法,既要求細胞的單位酶活力高,又要求細胞數量多,也就是說,給菌體在各種生理時期創造不同的條件。兩步法液體深層培養就是實現這種調節的具體措施之一。酶制劑生產兩步法的特點是將菌體生長條件(生長期)與產酶條件(生產期)區分開來。菌體先在豐富的培養基上大量繁殖,然后收集菌體濃縮物,洗滌后再轉入添加誘導物的產酶培養基,在此期間,菌體積累大量的酶,一般不再繁殖,營養成分或誘導物得到充分的利用。

    種子質量的控制 

           種子質量是影響發酵生產水平的重要因素。種子質量的優劣,主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養條件兩個方面。這就是說既要有優良的菌種,又要有良好的培養條件才能獲得高質量的種子。 

    ㈠ 影響孢子質量的因素及其控制 

           孢子質量與培養基、培養溫度、濕度、培養時間、接種量等有關,這些因素相互聯系、相互影響,因此必須全面考慮各種因素,認真加以控制。

    ⒈ 培養基 

           構成孢子培養基的原材料,其產地、品種、加工方法和用量對孢子質量都有一定的影響。生產過程中孢子質量不穩定的現象,常常是原材料質量不穩定所造成的。原材料產地、品種和加工方法的不同,會導致培養基中的微量元素和其他營養成分含量的變化。例如,由于生產蛋白胨所用的原材料及生產工藝的不同,蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸組分均有所不同,而這些營養成分對于菌體生長和孢子形成有重要作用。瓊脂的牌號不同,對孢子質量也有影響,這是由于不同牌號的瓊脂含有不同的無機離子造成的。 

           此外,水質的影響也不能忽視。地區的不同、季節的變化和水源的污染,均可成為水質波動的原因。為了避免水質波動對孢子質量的影響,可在蒸餾水或無鹽水中加入適量的無機鹽,供配制培養基使用。例如在配制生產四環素的斜面培養基時,有時在無鹽水內加入0.03%(NH4)2HPO4,0.028%KH2PO4及0.01%MgSO4,確保孢子質量,提高四環素發酵產量。 

           為了保證孢子培養基的質量,斜面培養基所用的主要原材料,糖、氮、磷含量需經過化學分析及搖瓶發酵試驗合格后才能使用。制備培養基時要嚴格控制滅菌后的培養基質量。斜面培養基使用前,需在適當溫度下放置一定的時間,使斜面無冷凝水呈現,水分適中有利于孢子生長。 

           配制孢子培養基還應該考慮不同代謝類型的菌落對多種氨基酸的選擇。菌種在固體培養基上可呈現多種不同代謝類型的菌落,各種氨基酸對菌落的表現不同。氮源品種越多,出現的菌落類型也越多,不利于生產的穩定。斜面培養基上用較單一的氮源,可抑制某些不正常型菌落的出現;而對分離篩選的平板培養基則需加入較復雜的氮源,使其多種菌落類型充分表現,以利篩選。因此在制備固體培養基時有兩條經驗:① 供生產用的孢子培養基或作為制備砂土孢子或傳代所用的培養基要用比較單一的氮源,以便保持正常菌落類型的優勢;② 作為選種或分離用的平板培養基,則需采用較復雜的有機氮源,目的是便于選擇特殊代謝的菌落。

    ⒉ 培養溫度和濕度 

           微生物在一個較寬的溫度范圍內生長。但是,要獲得高質量的孢子,其最適溫度區間很狹窄。一般來說,提高培養溫度,可使菌體代謝活動加快,縮短培養時間,但是,菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類,對溫度的敏感性是不同的。因此,培養溫度不同,菌的生理狀態也不同,如果不是用最適溫度培養的孢子,其生產能力就會下降。不同的菌株要求的最適溫度不同,需經實踐考察確定。例如,龜裂鏈霉菌斜面最適溫度為36.5~37 ℃,如果高于37 ℃,則孢子成熟早,易老化,接入發酵罐后,就會出現菌絲對糖、氮利用緩慢,氨基氮回升提前,發酵產量降低等現象。培養溫度控制低一些,則有利于孢子的形成。龜裂鏈霉菌斜面先放在36.5 ℃培養3天,再放在28.5 ℃培養1天,所得的孢子數量比在36.5 ℃培養4天所得的孢子數量增加3~7倍。 

           斜面孢子培養時,培養室的相對濕度對孢子形成的速度、數量和質量有很大影響。空氣中相對濕度高時,培養基內的水分蒸發少;相對濕度低時,培養基內的水分蒸發多。例如,在我國北方干燥地區,冬季由于氣候干燥,空氣相對濕度偏低,斜面培養基內的水分蒸發的快,致使斜面下部含有一定水分,而上部易干癟,這時孢子長得快,且從斜面下部向上長。夏季時空氣相對濕度高,斜面內水分蒸發得慢,這時斜面孢子從上部往下長,下部常因積存冷凝水,致使孢子生長得慢或孢子不能生長。試驗表明,在一定條件下培養斜面孢子時,在北方相對濕度控制在40%~45%,而在南方相對濕度控制在35%~42%,所得孢子質量較好。一般來說,真菌對濕度要求偏高,而放線菌對濕度要求偏低。 

           在培養箱培養時,如果相對濕度偏低,可放入盛水的平皿,提高培養箱內的相對濕度,為了保證新鮮空氣的交換,培養箱每天宜開啟幾次,以利于孢子生長。現代化的培養箱是恒溫、恒濕,并可換氣,不用人工控制。 

           最適培養溫度和濕度是相對的,例如相對濕度、培養基組分不同,對微生物的最適溫度會有影響。培養溫度、培養基組分不同也會影響到微生物培養的最適相對濕度。

    ⒊ 培養時間和冷藏時間 

           絲狀菌在斜面培養基上的生長發育過程可分為五個階段:① 孢子發芽和基內菌絲生長階段;② 氣生菌絲生長階段;③ 孢子形成階段;④ 孢子成熟階段;⑤ 斜面衰老菌絲自溶階段。 

           ⑴ 孢子的培養時間 基內菌絲和氣生菌絲內部的核物質和細胞質處于流動狀態,如果把菌絲斷開,各菌絲片斷之間的內容是不同的,有的片斷中含有核粒,有的片斷中沒有核粒,而核粒的多少亦不均勻,該階段的菌絲不適宜于菌種保存和傳代。而孢子本身是一個獨立的遺傳體,其遺傳物質比較完整,因此孢子用于傳代和保存均能保持原始菌種的基本特征。但是孢子本身亦有年輕與衰老的區別。一般來說衰老的孢子不如年輕孢子,因為衰老的孢子已在逐步進入發芽階段,核物質趨于分化狀態。孢子的培養工藝一般選擇在孢子成熟階段時終止培養,此時顯微鏡下可見到成串孢子或游離的分散孢子,如果繼續培養,則進入斜面衰老菌絲自溶階段,表現為斜面外觀變色、發暗或黃、菌層下陷、有時出現白色斑點或發黑。白斑表示孢子發芽長出第二代菌絲,黑色顯示菌絲自溶。孢子的培養時間對孢子質量有重要影響,過于年輕的孢子經不起冷藏,如土霉素菌種斜面培養4.5天,孢子尚未完全成熟,冷藏7~8天菌絲即開始自溶。而培養時間延長半天(即培養5天),孢子完全成熟,可冷藏20天也不自溶。過于衰老的孢子會導致生產能力下降,孢子的培養時間應控制在孢子量多、孢子成熟、發酵產量正常的階段終止培養。 

           ⑵ 孢子的冷藏時間 斜面孢子的冷藏時間,對孢子質量也有影響,其影響隨菌種不同而異,總的原則是冷藏時間宜短不宜長。曾有報道,在鏈霉素生產中,斜面孢子在6 ℃冷藏2個月后的發酵單位比冷藏1個月的低18%,冷藏3個月后則降低35%。

    ⒋ 接種量 

           制備孢子時的接種量要適中,接種量過大或過小均對孢子質量產生影響。因為接種量的大小影響到在一定量培養基中孢子的個體數量的多少,進而影響到菌體的生理狀態。凡接種后菌落均勻分布整個斜面,隱約可分菌落者為正常接種。接種量過小則斜面上長出的菌落稀疏,接種量過大則斜面上菌落密集一片。一般傳代用的斜面孢子要求菌落分布較稀,適于挑選單個菌落進行傳代培養。接種搖瓶或進罐的斜面孢子,要求菌落密度適中或稍密,孢子數達到要求標準。一般一支高度為20 cm、直徑為3 cm的試管斜面,絲狀菌孢子數要求達到107以上。 

           接入種子罐的孢子接種量對發酵生產也有影響。例如,青霉素產生菌之一的球狀菌的孢子數量對青霉素發酵產量影響極大,若孢子數量過少,則進罐后長出的球狀體過大,影響通氣效果;若孢子數量過多,則進罐后不能很好地維持球狀體。 

           除了以上幾個因素需加以控制之外,要獲得高質量的孢子,還需要對菌種質量加以控制。用各種方法保存的菌種每過1年都應進行1次自然分離,從中選出形態、生產性能好的單菌落接種孢子培養基。制備好的斜面孢子,要經過搖瓶發酵試驗,合格后才能用于發酵生產。

    ㈡ 影響種子質量的因素及其控制 

           種子質量主要受孢子質量、培養基、培養條件、種齡和接種量等因素的影響。搖瓶種子的質量主要以外觀顏色、效價、菌絲濃度或黏度以及糖氮代謝、pH值變化等為指標,符合要求方可進罐。 
    種子的質量是發酵能否正常進行的重要因素之一。種子制備不僅是要提供一定數量的菌體,更為重要的是要為發酵生產提供適合發酵、具有一定生理狀態的菌體。種子質量的控制,將以此為出發點。

    ⒈ 培養基 

           種子培養基的原材料質量的控制類似于孢子培養基原材料質量的控制。種子培養基的營養成分應適合種子培養的需要,一般選擇一些有利于孢子發芽和菌絲生長的培養基,在營養上易于被菌體直接吸收和利用,營養成分要適當地豐富和完全,氮源和維生素含量較高,這樣可以使菌絲粗壯并具有較強的活力。另一方面,培養基的營養成分要盡可能地和發酵培養基接近,以適合發酵的需要,這樣的種子一旦移入發酵罐后也能比較容易適應發酵罐的培養條件。發酵的目的是為了獲得盡可能多的發酵產物,其培養基一般比較濃,而種子培養基以略稀薄為宜。種子培養基的pH值要比較穩定,以適合菌的生長和發育。pH值的變化會引起各種酶活力的改變,對菌絲形態和代謝途徑影響很大。例如,種子培養基的pH值控制對四環素發酵有顯著影響。

    ⒉ 培養條件 

           種子培養應選擇最適溫度,前面已有敘述。培養過程中通氣攪拌的控制很重要,各級種子罐或者同級種子罐的各個不同時期的需氧量不同,應區別控制,一般前期需氧量較少,后期需氧量較多,應適當增大供氧量。在青霉素生產的種子制備過程中,充足的通氣量可以提高種子質量。例如,將通氣充足和通氣不足兩種情況下得到的種子都接入發酵罐內,它們的發酵單位可相差1倍。但是,在土霉素發酵生產中,一級種子罐的通氣量小一些卻對發酵有利。通氣攪拌不足可引起菌絲結團、菌絲粘壁等異常現象。生產過程中,有時種子培養會產生大量泡沫而影響正常的通氣攪拌,此時應嚴格控制,甚至可考慮改變培養基配方,以減少發泡。 

           對青霉素生產的小罐種子,可采用補料工藝來提高種子質量,即在種子罐培養一定時間后,補入一定量的種子培養基,結果種子罐放罐體積增加,種子質量也有所提高,菌絲團明顯減少,菌絲內積蓄物增多,菌絲粗壯,發酵單位增高。

    ⒊ 種齡 

           種子培養時間稱為種齡。在種子罐內,隨著培養時間延長,菌體量逐漸增加。但是菌體繁殖到一定程度,由于營養物質消耗和代謝產物積累,菌體量不再繼續增加,而是逐漸趨于老化。由于菌體在生長發育過程中,不同生長階段的菌體的生理活性差別很大,接種種齡的控制就顯得非常重要。在工業發酵生產中,一般都選在生命力極為旺盛的對數生長期,菌體量尚未達到最高峰時移種。此時的種子能很快適應環境,生長繁殖快,可大大縮短在發酵罐中的遲滯期(調整期),縮短在發酵罐中的非產物合成時間,提高發酵罐的利用率,節省動力消耗。如果種齡控制不適當,種齡過于年輕的種子接入發酵罐后,往往會出現前期生長緩慢、泡沫多、發酵周期延長以及因菌體量過少而菌絲結團,引起異常發酵等等;而種齡過老的種子接入發酵罐后,則會因菌體老化而導致生產能力衰退。在土霉素生產中,一級種子的種齡相差2~3 h,轉入發酵罐后,菌體的代謝就會有明顯的差異。
     
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