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    微生物分子育種技術

    放大字體  縮小字體 發布日期:2019-10-22  瀏覽次數:734
     ⒈ 鏈霉菌的基因克隆

    鏈霉菌基因克隆的基本步驟如下:
    ⑴ 制備供體DNA 對供體菌進行適當培養后,分離染色體DNA,用限制性內切酶將染色體DNA切成大小不等的DNA片段。
    ⑵ 制備載體DNA 載體是鏈霉菌質粒或噬菌體,往往是經過高度修飾的、能提供多種優良性狀的環狀DNA。它通常具備有復制起始點(提供自主復制能力)和遺傳標記(常為抗生素耐藥基因)。遺傳標記基因有兩種類型,當被克隆的供體DNA片段和載體連接時,一種遺傳標記基因不會失活,便于將來篩選轉化子。另一種遺傳標記基因中含有限制性內切酶位點,供體DNA片段插入該位置可使該基因功能喪失。分離載體DNA(質粒)時,為了挑選含有質粒的細胞,培養基中應含有適當量的藥物,分離到的載體DNA用限制性內切酶消化,使載體DNA產生與供體DNA片段末端相匹配的黏性末端。再用磷酸化酶脫磷,以防止沒有插入DNA時載體重新環化。
    ⑶ 連接載體和供體DNA片段 在連接酶作用下,利用限制性內切酶所切出的黏性末端來連接載體和供體DNA。
    ⑷ 將受體菌制成原生質體 選擇受體菌株應考慮受體菌表型、轉化效率、限制性內切酶活性和DNA酶活性。受體菌株必須缺乏一種酶活力,當基因克隆到載體并轉入受體菌時,可由該基因的產物來補充這種酶活性。例如克隆一種耐藥基因,就要求受體菌株對那種藥物敏感;克隆一種氨基酸生物合成有關的基因,就要求受體菌株是該種氨基酸的營養缺陷型。受體菌的轉化效率受自身的轉化能力、載體、已經轉化的原生質體的再生能力等因素的影響。受體菌的限制性內切酶活性能限制來自供體的插入DNA,因此需設法降低該酶的活性,解決此矛盾主要有如下三種方法:① 挑選限制性內切酶活性低的菌株為受體菌;② 對受體菌誘變,降低限制性內切酶活力;③ 對原生質體進行熱處理,以降低限制性內切酶活力。許多菌株具有不耐熱的限制性內切酶,原生質體在45~50 ℃培養10~15 min,使其限制性內切酶變性,但原生質體存活,且能進行轉化。一些鏈霉菌具有使DNA降解的DNA酶,它由原生質體往外滲漏,或是存在于某些原生質體溶解后的溶液中。因此,如果質粒DNA加到原生質中時,將有部分DNA降解,而使得轉化效率降低。可用熱處理或在加入質粒DNA之前先在原生質體中加入異源DNA(如小牛胸腺DNA),以減少DNA酶對質粒DNA的降解。
    受體菌的原生質體制備一般需將細胞在含有0.5%的甘氨酸的培養基中培養,使菌絲體對溶菌酶的處理更加敏感。
    ⑸ 轉化作用 用PEG將DNA導入原生質體中。
    ⑹ 再生和選擇 在轉化之后,要有一定時間讓編碼耐藥酶的基因進行表達,同時在細胞內形成足夠量的耐藥酶以顯示耐藥表型。因此,假如被轉化的原生質體直接涂在含有藥物的培養基上,它們將會被殺死。相反,當它們被涂在不含有藥物的再生培養基上,與未被轉化的原生質體一起進行一段時間的非選擇性再生。此后,加藥物到再生培養基上,那么沒有被轉化的原生質體被殺死,而轉化體存活下來了。

    ⒉ 鏈霉菌抗生素生物合成基因的克隆

      典型的抗生素并非單一基因的產物,因此只有把所有與該抗生素生物合成有關的結構基因克隆到適宜的宿主中去才能得到一個理想的克隆體。如果所用的宿主對這個抗生素是敏感的,還需將抗性基因一起轉入宿主。幸運的是合成某種抗生素所需的全套基因,甚至包括抗性基因往往排列成簇,這就使得分離抗生素生物合成基因比原來想象的要容易一些。在克隆抗生素生物合成基因方面前人已總結出如下七個克隆策略。
    ⑴ 檢測克隆到標準宿主中的個別基因產物;
    ⑵ 利用產生菌阻斷突變株的互補作用;
    ⑶ 利用突變克隆技術;
    ⑷ 連鎖的抗生素抗性基因的克隆;
    ⑸ 用人工合成的寡核苷酸探測基因文庫(gene library);
    ⑹ 直接克隆抗生素產生菌DNA大片段到非產生菌中;
    ⑺ 用一種抗生素的克隆DNA去探測相關抗生素的同源基因。

    ⒊ 利用基因工程技術生產新的抗生素

    將一種抗生素生物合成基因引入產生結構相近似的抗生素產生菌,可改造抗生素的結構。如將放線紫紅素全部生物合成基因轉入曼得霉素或榴霉素產生菌,得到曼得紫紅素或二氫榴紅霉素。外源基因的作用可分為兩種情況。第一種情況是,外源基因轉入后,使原來不具備羥化酶基因的曼得霉素產生菌獲得了來自放線紫紅素產生菌的羥化酶基因。由于放線紫紅素和曼得霉素的結構相似,放線紫紅素產生菌的羥化酶基因產物,可使曼得霉素羥基化。第二種情況是放線紫紅素的生物合成基因產物,利用了原來存在于榴霉素產生菌中能合成放線紫紅素部分結構的前體物質,與榴霉素生物合成酶共同起作用,合成了兼有二者結構的二氫榴紅霉素。
    隨著基因工程育種技術的發展,目前已可能將供體菌的個別基因從一整套的生物合成基因中轉移給別的鏈霉菌,或者將其完整的生物合成基因轉移到別的鏈霉菌進行重組,并得到表達。這樣,人們有可能運用基因工程育種技術人為地剔除某個有害的基因或引進某個需要的基因去改造已有的抗生素結構。例如,將布替羅星的側鏈的生物合成基因引入卡那霉素產生菌并得到表達,就可以不經過化學方法的結構改造直接生物合成丁胺卡那霉素。

    ⒋ 利用基因工程技術生產氨基酸

    氨基酸生產菌的基因克隆系統多采用“鳥槍”法,即利用一種或幾種限制性內切酶將某一菌株的DNA分子切割成相當于一個或者大于一個基因的片段,然后將這些片段一一與載體連接,制成重組DNA分子,轉化到另一菌株中進行體內無性繁殖,最后對所有帶有重組DNA分子的細菌(組成基因文庫)進行培養和選擇,從中挑出含有目的基因的轉化子。
    利用基因工程技術將氨基酸合成酶基因克隆是提高氨基酸產量的有效途徑。目前,幾乎所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系統中克隆與表達。其中蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸和組氨酸等的工程菌已達到工業化生產水平。例如在L-色氨酸生產中,利用色氨酸合成酶基因和絲氨酸轉羥甲基酶(催化甘氨酸和甲醛合成絲氨酸的酶)基因的重組質粒,在大腸桿菌中克隆化。通過添加甘氨酸來制造L-色氨酸,該方法能使上述兩種酶的活性提高而增產L-色氨酸。基因工程育種技術還應該和其他育種技術相結合才更為有效。例如色氨酸的工程菌經過菌種篩選,工程菌的色氨酸產量由最初的6.2 g/L上升到50 g/L。
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