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    PCR技術在微生物檢測中的應用

    放大字體  縮小字體 發布日期:2019-10-22  瀏覽次數:750
     PCR即聚合酶鏈式反應,是一種體外擴增DNA序列的技術。現代PCR概念最早是由美國科學家Kary Mullis于20世紀80年代早期發明的,他也因此榮獲了1993年的諾貝爾化學獎。如今該技術已成為生物前沿技術之一。

    PCR技術的基本原理類似于細胞內DNA的復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。簡單來說PCR包括變性—退火—延伸三個基本反應階段。其基本過程為:①檢測樣品經預處理后獲得DNA模板;②DNA模板的變性:模板DNA經加熱至95℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈,以便它與引物結合,為其后階段反應做準備;③模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,這時人工合成的引物與模板DNA單鏈經互補序列配對結合;④引物的延伸:DNA模板—引物結合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下,以4種三磷酸脫氧核苷酸為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原則,合成一條新的與模板DNA 結構組成相同的新鏈。重復循環變性—退火—延伸三過程,就可獲得更多的新鏈,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,一般單一拷貝的基因循環25~30次DNA便可擴增l00萬~200萬倍。PCR反應產物再通過凝膠電脈和基因測序等DNA分析技術確定擴增DNA序列的具體信息。

    1PCR技術在微生物檢測的應用前景

    依據一次性使用衛生用品衛生標準(標準號:GB 15979—2002)中的微生物指標規定,在一次性使用衛生用品中是不能有大腸桿菌以及3種致病性化膿菌(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌)的檢出。該要求是對4種菌的定性檢測,標準中用到的檢測方法是傳統的微生物鑒定法,先通過增菌或分離培養,然后進一步根據各菌群特征做一些鑒定試驗,最后綜合各項結果判斷。通常這種傳統的檢測方法時間較長,而且在菌量少的情況下易出現假陰性的結果。而在環境監測、食品檢測等領域中已經應用的PCR技術則可縮短檢測所消耗的時間,且敏感性更高。

    1.1 大腸桿菌的檢測

    相關研究顯示,通過大腸桿菌特異性引物(上游引物:5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’ ,下游引物:5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’)進行PCR擴增可以檢出飲用水中的大腸桿菌,即使在菌量極低的情況下也可以檢出。但該研究還發現對于不能夠破壞微生物DNA的消毒方法會造成PCR檢測的假陽性,而GB 15979—2002中對一次性使用衛生用品所使用到的消毒方法通常為環氧乙烷消毒、電離輻射消毒和壓力蒸汽消毒。而這幾種滅菌方法都會直接破壞微生物的核酸,因此PCR技術用于檢測一次性使用衛生用品中致病菌有可行性。

    1.2 綠膿桿菌的檢測

    相關研究表明使用綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因作為模板來快速檢測綠膿桿菌。ETA基因僅在綠膿桿菌基因組中存在,且Gray等人已經從一個過量表達ETA的綠膿桿菌菌株中克隆和測定了ETA的結構基因。因此ETA基因可以作為檢出綠膿桿菌的靶基因。根據ETA基因序列設計特異性引物,通過PCR反應擴增目的基因序列,如果能夠擴增出目的條帶,那就能據此來確定綠膿桿菌的存在。

    1.3 金黃色葡萄桿菌和溶血性鏈球菌的檢測

    PCR技術用于檢測金黃色葡萄球菌的研究多數是關于食品衛生。張亞蘭[8]的研究將PCR的反應做了優化,消除了一些會影響PCR反應的抑制因素,從而提高檢測方法的靈敏度。同時應用PCR技術檢測鏈球菌的研究數據顯示這種方法具有可行性。

    2 PCR技術在應用過程中可能存在的問題

    PCR技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性。此外,與傳統的微生物檢測法相比PCR技術能縮短檢測時間,但同時將該技術引進到衛生用品的檢測也存在一些問題。首先,由于檢測樣品是衛生用品,在樣品的預處理、樣品DNA的提取等具體的操作過程中可能會遇到不同的問題;其次,盡管PCR反應的步驟很簡單,但是具體的操作是復雜的,如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環數等。因此不同的反應體系應該確定適當的反應條件以避免假陰性或假陽性等情況的產生。所以要引入PCR技術來檢測衛生用品中的微生物,需要進行預試驗,完善檢測方法。
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